当时孙慎行以红丸案指责前任首辅方从哲，高攀龙也引《春秋》典故归罪方从哲。给事中王志道为方从哲辩解，被高攀龙上疏严厉斥责。不久高攀龙被调任太常少卿，又上一道《恭陈圣明务学之要疏》，向熹宗阐明读书的重要性。方从哲一派故意摘出疏中指责帝王不孝的言辞激怒熹宗，熹宗欲严惩高攀龙。叶向高极力挽救，才得以罚俸一年而作罢。

　　天启二年（1622年）九月，高攀龙调任大理寺右少卿。十一月，升任太仆卿、刑部右侍郎。

　　天启四年（1624年）八月，高攀龙升任都察院左都御史，上《纠劾贪污御史疏》弹劾御史崔呈秀。疏中揭露崔呈秀在巡按淮扬地区时贪赃枉法、铺张浪费。吏部尚书赵南星经复查认为事实确凿，提请将崔呈秀戍边。崔呈秀得知后连夜投奔魏忠贤，认魏忠贤为义父。

　　此时以魏忠贤为首的阉党势力日益扩张，控制了朝廷内外。东林党人如杨涟等纷纷上书参劾魏忠贤，双方争斗进入白热化阶段。

被诬自尽

　　此时魏忠贤正借机大肆迫害东林党人，称高攀龙与赵南星结党营私，皇帝下旨严厉斥责。不久后南京御史游凤翔出任知府，攻击高攀龙徇私、排挤同僚，高攀龙因而被罢黜。

　　高攀龙等人被罢官后，以魏忠贤为首的阉党控制了朝廷大权，编派了《缙绅便览》、《点将录》、《天鉴录》、《同志录》等黑名单，将不依附于自己的官员开列在内，予以打击。

　　天启五年（1625年）八月，魏忠贤矫旨，以东林书院为始将全国书院尽数拆毁。

　　天启六年（1626年）二月，崔呈秀不甘心高攀龙仅被罢官，必欲除之。于是假造浙江税监李实的奏本，诬告高攀龙、周起元等七人贪污，派遣缇骑前来抓捕。三月，高攀龙整冠束带前去拜谒先贤杨时的祠堂。回家后与弟弟高士鹤及门生赏花于后花园池畔，谈笑自如。此时有人前来禀告周顺昌已被逮捕，高攀龙闻言神情泰然，笑说：“我本视死如归”。归家后与夫人谈笑如常，没有异样。亲笔书信交给两个孙子，交代翌日递给校官，而后闭门遣散诸孙。不多时高攀龙的儿子们（发觉异样）前来探查，发觉高攀龙已自沉于池塘，时年六十四（虚岁六十五）。