隆安三年（399年）桓玄请求扩大其辖区，而执政司马元显（司马道子之子）亦想趁机离间桓玄与殷、杨二人的关系，故此加桓玄都督荆州长沙郡、衡阳郡、湘东郡及零陵郡四郡诸军事，并改以桓玄兄桓伟代杨佺期兄杨广为南蛮校尉。此举触怒了杨佺期兄弟，杨佺期更以支援后秦围攻的洛阳为名起兵，但皆被殷仲堪阻止。当年荆州有大水，殷仲堪开仓赈济灾民，桓玄就乘此机会起兵，亦以救援洛阳为名。当时桓玄写信给殷仲堪，称他要消灭杨佺期，并命殷仲堪收杀杨广，否则会进攻江陵。桓玄袭取殷仲堪在巴陵的积粮，又向路经夏口的梁州刺史郭铨假称收到朝廷下令命郭铨为自己前锋以讨杨佺期，故此授江夏兵予他，命他督诸军前进。
当时桓玄密报桓伟作为内应，但桓伟遑恐，更向殷仲堪自首，于是被殷仲堪掳为人质，并命其写信给桓玄，在信中苦劝桓玄罢兵，不过桓玄不为所动，自度桓伟必因殷仲堪优柔寡断、常虑儿子的性格而无危险。殷仲堪亦派殷遹率七千水军至西江口，桓玄派郭铨和苻宏击败他；及后殷仲堪又派杨广及殷道护进攻，桓玄再在杨口击败他们，直逼至离江陵二十里的零口，震动江陵。后杨佺期自襄阳来攻，桓玄一度退后避其锋锐，但终大败杨佺期，及后由部将冯该并追获及杀掉他。殷仲堪出奔，又被冯该追获，及后被桓玄逼令自杀。
桓玄年末消灭了杨佺期和殷仲堪，于是在次年（公元400年）向朝廷求领荆江二州刺史。朝廷下诏以桓玄都督荆司雍秦梁益宁七州诸军事、后将军、荆州刺史、假节；另以桓伟为江州刺史。但桓玄坚持要由自己领江州刺史，朝廷唯有让桓玄加都督江州及扬州豫州共八郡诸军事，领江州刺史；桓玄又以桓伟为雍州刺史，朝廷碍于当时孙恩叛乱恶化，不能违抗。桓玄于是趁机在荆州任用腹心，训练兵马，并屡次请求讨伐孙恩，但都被朝廷阻止。
隆安五年（401年），孙恩循海道进攻京口，逼近建康，桓玄声称勤王起兵，实际是想浑水摸鱼，于是司马元显在孙恩北走远离京师后下诏命桓玄解严。不过，桓玄当时完全控制了其辖区，不但作出调桓伟为江州、镇守夏口，又以司马刁畅督八郡、镇守襄阳，桓振、皇甫敷、冯该等驻湓口等军事调动，更建立了武宁郡和绥安郡分别安置迁徙的蛮族以及招集的流民。朝廷曾下诏征广州刺史刁逵和豫章太守郭昶之，亦被桓玄所留。
