自万历十三年起，申时行便公开与言官对阵了。这年，御史张文熙上疏，历数从前的阁臣专恣自断的四种表现：各部各院都设《考成簿》，记录官吏功过，送内阁考察升降；吏部、兵部挂选官员，都得经内阁认同；督抚巡接办事，无不密谒内阁大臣请教；内阁首辅奉诏拟旨，独自行事。申时行上疏论争，对前三条，他认为是内阁的职权范围许可的，内阁中有徇私舞弊的可罢黜，但若因有一、二个阁臣徇私舞弊就把内阁的职权削弱，未免因噎废食。对最后一条，他说内阁首辅奉诏拟旨，曾无专断之举，都同内阁其他大臣商议。神宗觉得申时行讲得有理，遂绌张文熙之议不用。

　　此后，言官与申时行的矛盾冲突更加激烈，内阁其他大臣也卷入。“高启愚案”是言官与阁臣争斗的典型事例之一。

　　御史丁此吕上疏揭发礼部侍郎高启愚主持南直隶乡试时，出题《舜亦以命禹》，是劝进张居正当皇帝。神宗将他的奏疏批示申时行处理。申时行说："丁此吕以这种暖昧问题陷人于死罪，臣恐谗言接踵而至，不是清明王朝所应有的。"吏部尚书杨巍秉承申时行心意，建议将丁此吕贬出京师，神宗采纳。这下，惹怒了众言官，给事中、御史王士性、李植等纷纷上疏弹劾杨巍阿申时行意，蔽塞言路。神宗又觉得他们讲得有道理，诏令罢免高启愚，丁此吕留任。申时行见状，遂与杨巍一同上疏辞官。内阁大臣余有丁、许国上疏反对留任丁此吕，许国是申时行的好友，采取一致行动，也上疏辞官，向神宗施加压力。于是，神宗乃维持原来的判决，贬丁此吕出京。言官们群起攻击许国，申时行奏请按情节轻重惩治众言官。言官们与阁臣更加对立，有如水火。

　　皇储问题

　　神宗的长子是朱常洛，他的母亲王氏是慈圣皇太后的侍女，一次，神宗去朝见母后，遇上了王氏，一时冲动，临幸了她，遂有朱常洛。但神宗并不喜欢王氏，也不爱她生的朱常洛。朱常洛4岁那年上，神宗宠爱的郑贵妃生下了朱常洵，子以母贵，朱常洵倍受神宗的宠爱，神宗意欲立他为皇储。废长立少，是不合乎封建礼法的，公卿大臣怕神宗真的走这步棋，遂推内阁首辅申时行为首，联名上疏，请立朱常洛为皇储。神宗置之不理。